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符合2015美国药典--重组胰蛋白酶标准的酶活性及纯度RP-HPLC测定
发布日期:2018-01-30  来源:中国生化药物杂志   浏览次数:129
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胰蛋白酶丝氨酸蛋白酶的一种,可以特异性识别和水解肽链中精氨酸和赖氨酸的羧基端[1],首先以酶原形式被合成,通过水解N末端的酶原前肽激活成为单链的β-trypsin[2],接下来通过自水解作用可以产生几种由二硫键相连的多链胰蛋白酶α-trypsin,α-trypsin也会进一步自水解形成ψ-trypsin,不同的活性和热稳定性及特异性是它们性质上的主要差异[3-4]。目前在细胞培养、重组胰岛素、硫酸软骨素、胶原蛋白等生物产品的制备方面有着广泛的应用。以往通过从动物胰腺提取的方法获得胰蛋白酶,提取胰蛋白酶其自降解程度很明显并常常伴有糜蛋白酶等,以及一些病原微生物的可能污染。重组胰蛋白酶可从根本上解决动物源性胰蛋白酶的病毒、真菌、支原体等的污染问题[5]。动物细胞培养时,使用重组胰蛋白酶代替提取胰蛋白酶进行细胞消化[6],减少了动物细胞生产药物时病原及微生物污染的可能。经马强等人的研究发现可以通过定点突变的方法将人源阴离子胰蛋白酶的自降解位点122位精氨酸突变为亮氨酸,从而部分限制了胰蛋白酶的自水解,提高了胰蛋白酶的稳定性[7]。重组胰蛋白酶经包涵体表达、然后通过变性、复性的方法得到成熟的胰蛋白酶,然后经HPLC纯化获得高纯度的重组胰蛋白酶。研究及在生物制药中的应用已证实了重组胰蛋白酶的质量稳定性、高纯度和特异性。高纯度的重组胰蛋白酶还可以用于多肽测序、质谱鉴定等。2015版美国药典对于生物药用辅料酶的实例[8]中,第一次给出了重组胰蛋白酶检测标准和方法,该标准的制订旨在提高生物医药生产过程中辅料的质量和安全性,提高人们用药安全。本研究对于上海雅心生物的重组胰蛋白酶按照该标准的方法进行了测定。

1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
T6紫外分光光度计(北京普析通用仪器公司);重组胰蛋白酶,上海雅心生物技术有限公司;BAEE(Sigma);LC-2010A HT型液相色谱仪(日本岛津有限公司),其它试剂均为分析纯。
1.2重组胰蛋白酶活性检测
本研究中采用中国药典和美国药典规定的胰蛋白酶的活性测定方法。具体如下:以N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(N-benzoyl-L-arginine ethyl ester,BAEE)作为底物检,由于胰蛋白酶可特异性水解精氨酸羧基端的肽键,故可将N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)降解为N-苯甲酰-L-精氨酸(benzoyl-L-arginine,BA)。在253nm波长下,BAEE的吸收值远远小于其降解物BA。在一定的条件下,随着催化反应的进行,产物 BA逐渐增多,体系的紫外吸收值逐渐增加,最后以253nm下紫外吸收值的变化量△A253nm计算胰蛋白酶的活性,每分钟使△A253nm增加0.001的酶量为一个BAEE单位,每分钟使△A253nm增加0.003的酶量为一个USP单位。具体操作如下:精确称取重组胰蛋白酶冻干粉,用1mmol/L HCL溶解配制成1mg/ml。取光程为1cm的带盖石英比色杯,加入25℃预热过的3.0mL 0.25mmol/L BAEE底物溶液,在253nm的波长处,立即调零。经1mM HCl 稀释后,加入适量待测酶液,立即盖上盖迅速混匀计时,每半分钟读数一次,共读3~4min,呈线性关系的时间不得少于3 分钟。以时间(t)为横坐标,光吸收值( A253nm)为纵坐标作图,求斜率,即为△A253nm/min。测活过程中控制△A253nm/min在0.055-0.065之间。
在配制BAEE底物时,使用的缓冲液为67mmol/L 磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液pH 7.6。底物的工作浓度为0.25mmol/L,测活温度为25℃。计算公式如下:


1.3重组胰蛋白酶纯度检测
参照美国药典2014中对重组胰蛋白酶RP-HPLC测定方法的规定,采用C18柱(EF-C18(H) 4.6×250 mm,3 μm 220Å)对其进行纯度检测。
流动相A:含有0.1% H3PO4(85%)水溶液。流动相B:含有0.1% H3PO4(85%)的乙腈。使用前用0.22μm滤膜过滤除菌,超声脱气。

表 1 HPLC 流动相洗脱程序
Table 1 Mobile phase elution program of HPLC
Time/min Solution A % Solution B %
0 75 25
25 55 45
30 10 90
34 10 90
35 75 25
45 75 25
上样液,精密称取重组胰蛋白酶冻干粉5-10mg,用1mmol/L HCL配制10mg/ml的溶液。进样量为10- 20μl,每次上样总蛋白不小于50μg。流速1.0 mL/min。柱温40 ℃。检测波长280 nm。
分辨率:α-trypsin与β-trypsin主峰之间的距离不小于1
记录层析图谱,计算峰面积,用面积归一化法计算胰蛋白酶的纯度。积分的时间为25min内,积分时要有空白对照,有前洗脱肩峰为α-胰蛋白酶,如果或者如果仅有一个最低的峰形成,积分时用垂线的方法,有后拖尾肩峰的为β-trypsin,如果或者如果仅有一个最低的峰形成,采用切向积分。
验收标准:
β-trypsin的峰面积占比不低于70%,α-trypsin的峰面积占比不高于20%。

1.4重组胰蛋白酶浓度及比活测定
蛋白浓度测定采用美国药典规定的吸光系数法,即1%重组胰蛋白酶的在280nm下的质量吸光系数为13.6。精密称取冻干粉5-10mg,将冻干粉用1mmol/LHCl溶解为1mg/ml,在280nm波长下测定光吸收值,以1mmol/L HCl为空白对照调零。如样品A值超过1,则适当稀释。代入公式计算蛋白浓度。
计算蛋白浓度(mg/ml):


A1=样品的吸光值
A0=空白对照的吸光值
F=1%(10mg/ml)到1mg/ml的换算因数10
胰蛋白酶的消光系数13.6
D=稀释因子

胰蛋白酶比活测定,按照胰蛋白酶活性测定方法,测定胰蛋白酶活性,比活性为酶活力单位与蛋白浓度的比值。计算公式如下:


2结果
2.1重组胰蛋白酶比活性检测
根据方法1.2中的测定方法和公式可以得到重组胰蛋白酶的活性,经过对5个平行样品的测量,最终计算重组胰蛋白酶冻干粉样品溶液活性为3690USP units/ml。蛋白含量为82%。
根据测定的活性和胰蛋白酶浓度的结果,计算胰蛋白酶比活,得到胰蛋白酶比活为4500USP Units/mg。

2.2重组胰蛋白酶纯度检测
采用HPLC胰蛋白酶美国药典的标准,分析胰蛋白酶中不同构型的胰蛋白酶,其中根据胰蛋白酶构型不同,α-trypsin和β-trypsin的保留时间为12-17min。

图 1 重组胰蛋白酶的HPLC检测
Fig 1 The result of recombinant trypsin HPLC analysis

从图1上可以看出,胰蛋白酶出峰时间为13-15.5min,主峰3为β-trypsin,之前有两个小峰1、2为α-trypsin,两种α-trypsin出峰时间分别为13.426 min和14.088min,其所占比例为2.37%和6.26%,而β-trypsin出峰时间为14.549min,所占比例为91.37%。这一检测结果说明重组胰蛋白酶符合药典标准,β-trypsin应不少于70%,而α-trypsin应不多于20%。
 
 
 
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