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石榴汁对慢性脑低灌注大鼠认知行为的影响及机制
发布日期:2018-03-10  来源:中华神经医学杂志   浏览次数:62
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慢性脑低灌注(chronic cerebral hypoperfusion,CCH)是神经系统疾病中常见的一种慢性缺血性病理改变,多由于脑血管管腔狭窄、畸形、动静脉瘘形成等原因引起脑组织长期处于低灌注状态,脑部血流供应减少,神经元慢性缺血缺氧,最后导致脑组织不可逆性损伤。脑缺血缺氧后大量活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)的产生和堆积造成脑组织氧化损伤,称为氧化应激(oxidative stress )【1,2】。8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-2'-deoxyguanosine,8-OHdG)是DNA氧化应激损伤后的主要产物,氧化应激造成DNA双链断裂、单链断裂、碱基修饰受损,可用于评估DNA氧化应激损伤的程度【3,4】。4-羟壬烯醛(4-hydroxynonenal,4-HNE)是脂质氧化应激损伤常见的醛类产物,能与细胞内的核酸、蛋白酶类等物质发生一系列复杂的病理损伤反应,是评估脂质过氧化损伤水平的常用检测指标【5】;石榴汁(pomegranate juice)富含各种多酚类化合物,主要有没食子鞣质、逆没食子酸鞣质、鞣花酸、花青苷类等,它具有抗氧化、抗过敏、降脂、抗动脉粥样硬化、抗癌、抗炎症及抗菌免疫调节等多种功能【6】。石榴汁抗氧化作用的有效性在体内外研究中均已被广泛证实,然而石榴汁对慢性脑低灌注大鼠认知行为的影响还未明了。本实验基于永久性结扎大鼠双侧颈总动脉,模拟大鼠在慢性脑低灌注状态下认知行为功能损害,探讨石榴汁对慢性脑低灌注状态下大鼠的认知行为和皮质与海马CA1区的8-0HdG和4-HNE的表达水平的影响,及石榴汁对此影响的作用机制。
材料与方法
一、材料
健康Wistar雄性大鼠40只,SPF级,购于湖北省疾病预防控制中心,体重200-250g,放置中南医院动物房饲养,每笼3只,保持适宜的温度、湿度和通风,保证每天充足水和食物。购买陕西临潼质好红酸石榴,经清洗、消毒、榨取、离心和低温真空浓缩器缓慢蒸发制备石榴汁,石榴汁中多酚类物质含量2.4-4.8mg/ml。
二、方法
1.慢性脑低灌注大鼠模型的制备(2VO模型) 随机分成3组,石榴汁组、2VO组和假手术组,分别是16只、16只、8只。术后3天和灌胃过程中共死亡17只,死亡率为42.5%。最后石榴汁组8只,2VO组7只,假手术组8只。
2.给药方法 术后1周开始给予药物干预,石榴汁组每天给予2ml石榴汁灌胃;2VO组与假手术组每天给予2ml糖水灌胃(蔗糖250mg,果糖20mg,葡萄糖20mg);均于下午进行;共7周。
3.Morris水迷宫空间认知行为学检测
术后第8周,对3组大鼠进行Morri水迷宫的空间学习和记忆能力试验。Morris水迷宫直径150 cm,高60 cm圆形水池,上方安装摄象头观察与记录大鼠的行为轨迹。在水池壁上标记4个大鼠的入水点,分别记为A、B、C、D点;水池相应地分成4个象限。在第1象限正中点离池壁30cm处放置一个圆形平台,直径9cm,高30 cm。水深32cm,平台低于水面1.5cm,加入黑色墨汁防止大鼠看见水下平台,保持水温24±2℃。水迷宫测试时,实验室保持安静和亮度适中,训练期间迷宫外参照物保持不变。定位航行实验 (place navigation) 用于检测大鼠的空间学习能力。每只大鼠每天进行4次训练,每次分别从A、B、C、D点把大鼠投入到水池中,每天依次选择一个象限开始作为大鼠入水点,连续训练5天。观察和记录大鼠爬上平台所需时间,即为潜伏期时间(escape latency)。如大鼠60s内找到平台,记录大鼠找到平台的实际时间记为潜伏期时间。如60s内未找到平台,则将潜伏期时间记为60s,再把大鼠引到平台上和停留15s。每只大鼠训练时间间隔1小时。空间探索试验用于检测大鼠对原平台的空间记忆能力。定位航行实验结束后,间隔1天,去掉水池里的平台,随机选择一个象限作为大鼠入水点,观察并记录大鼠在30秒内在原先放置平台的第1象限游泳时间,每只大鼠进行4次检测,每次间隔时间l小时。
4.脑组织取材
Morri水迷宫试验结束后第2天行大鼠脑组织取材,根据大鼠体重给予0.35ml/100g的10%水合氯醛腹腔麻醉注射,后暴露心脏,快速灌注PBS液3-5min,待大鼠双肺和前肢变白时改用4%多聚甲醛脑灌注液经左心室开始灌注,大鼠出现剧烈抽搐,后肢绷直僵硬,鼠尾竖起成一直线,再行断头取脑术,后放置在4%多聚甲醛溶液中固定,24小时内石蜡包埋与切片,切取含大脑皮质和海马CA1区,厚度为5μm。
5.免疫组织化学染色
将3组大鼠的皮质和海马CA1区进行8-OHdG和4-HNE检测,严格按照试剂盒说明书进行操作,细胞膜为黄棕色时为阳性反应,8-OHdG试剂盒购买自香港Abcam公司,4-HNE试剂盒购买自美国ADI公司。每组内每张切片分别在皮质和海马CA1区随机挑选3个200倍视野进行拍照。应用Image-Pro Plus6.0软件对每张照片进行分析并得出每张照片阳性的累积光密度值(IOD)。IOD越大,阳性表达越强。每组所有照片的平均值代表该组的IOD,用均数±标准差表示。应用SPSS18.0进行显著性检验。
三、统计方法
数据统计方面,潜伏期时间用均数±标准差表示,双因素方差分析,采用F检验组间比较。目标象限游泳时间用均数±标准差表示,用单因素方差分析,两两比较采用T检验。8-OHdG和4-HNE含量用均数±标准差表示,采用单因素方差分析和LSD法统计学分析。当P<0.05时,具有统计学意义。
结果
一、Morris水迷宫空间认知行为学试验
1.逃离潜伏期试验结果
首先,统计3组大鼠每天在4个象限中的潜伏期时间,取其平均值,得到大鼠当天的Morris水迷宫平均潜伏期时间。经过5天训练后,3组大鼠的组内平均潜伏期也有显著性差异(F4,100=56.03,P<0.01);第4、5天,2VO组潜伏期时间显著多于假手术组,差异具有显著性(P < 0.01),而石榴汁组潜伏期时间显著少于2VO组,差异具有显著性(P<0.05)。结果见表1。
表1 石榴汁对慢性脑低灌注大鼠空间学习的影响(Mean±SD,s)
组别 大鼠(只) 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天
假手术组 8 49.2±7.3 30.8±10.3 22.8±9.8 12.7±7.7 7.7±5.6
石榴汁组 8 52.9±6.9 38.6±10.6 33.9±8.2 21.4±7.1 13.6±6.1
2VO组 7 51.9±6.4 41.8±8.11 40.6±13.0 33.8±12.2 25.9±11.3
P值 P > 0.05 P > 0.05 P > 0.05 <0.05 <0.05
注:与2VO组比较,潜伏期时间显著减少,P<0.05。
2.空间探索试验结果
主要用于检测大鼠对原平台位置的空间记忆能力。在30秒内,大鼠出现在原平台所在象限的时间,即为目标象限游泳时间。2VO组目标象限游泳时间(6.343±1.220s)较假手术组(10.05±1.688s)显著减少,差异有统计学意义(P<0.01)。石榴汁组目标象限游泳时间(8.950±2.371s)较2VO组显著增加,差异具有统计学意义 (P<0.05)。
二、石榴汁对慢性脑低灌注大鼠8-OHdG的影响
在大鼠顶叶皮质和海马CA1区用8-OHdG免疫组化染色观察DNA氧化应激损伤程度。在慢性脑低灌注损伤后,顶叶皮质和海马CA1区含有大量呈黄棕色颗粒的8-OHdG阳性表达。3组大鼠皮质和海马CA1区8-OHdG的IOD分别是假手术组(1788.82±183.01、655.67±151.28)、石榴汁组(4130.40±213.55、1665.86±57.15)和2VO组(11515.34±921.73、2776.47±188.10)。结果显示:8-OHdG在皮质和海马CA1区的含量依次为假手术组<石榴汁组<2VO组,经石榴汁干预后,大鼠皮质和海马CA1区8-OHdG的表达较2VO组明显减少。经LSD法方差分析,P值均小于0.01,说明3组大鼠之间的皮质和海马CA1区8-OHdG表达具有差异性。结果如图1-6。(见附页)
图1-3分别为假手术组、石榴汁组和2VO组大鼠皮质8-OHdG的表达情况 (200倍视野)
(见附页)
图4-6分别为假手术组、石榴汁组和2VO组大鼠海马CA1区8-OHdG的表达情况(200倍视野)(见附页)

三、石榴汁对慢性脑低灌注大鼠4-HNE影响
在大鼠顶叶皮质和海马CA1区用4-HNE免疫组化染色观察脂质氧化应激损伤程度。在慢性脑低灌注损伤后,大鼠顶叶皮质和海马CA1区含有大量呈黄棕色颗粒的4-HNE阳性表达。3组大鼠皮质和海马CA1区4-HNE的IOD分别是假手术组(1459.47±233.57、442.22±62.98)、石榴汁组(3150.87±173.64、1501.96±252.77)和2VO组(8695.24±326.58、2546.31±430.74)。结果显示:4-HNE在大鼠皮质和海马CA1区的含量依次为假手术组<石榴汁组<2VO组,经石榴汁干预后,大鼠的皮质和海马CA1区4-HNE的表达明显减少。经LSD法方差分析,P值均小于0.01,说明3组大鼠之间的皮质和海马CA1区4-HNE表达具有差异性。结果如图7-12。
图7-9分别为假手术组、石榴汁组和2VO组大鼠皮质4-HNE的表达情况(200倍视野)(见附页)

图10-12 分别为假手术组、石榴汁组和2VO组大鼠海马CA1区4-HNE的表达情况(200倍视野)(见附页)

讨论
慢性脑低灌注状态在老年人中较为常见,经相关的临床检查常发现脑血流量减少和脑白质稀疏,常引起认知功能的下降。慢性脑低灌注引起脑组织缺血缺氧,后继发兴奋性氨基酸毒性、酸中毒、离子的失衡、氧化应激、炎症介质和细胞调亡等一系列复杂的级联反应,其中氧化应激损伤可能起着关键作用【7】。慢性脑低灌注时,脑组织的氧化应激系统与抗氧化激系统失衡,自由基代谢平衡紊乱,导致大量活性氧自由基的产生和堆积,造成神经元氧化应激性损伤。2VO模型常用于慢性脑低灌注损伤研究,永久性结扎双侧颈总动脉后脑组织缺血效果明显,大脑皮质、海马、脑白质和视觉系统最容易受到破坏,皮质与海马的脑血流量减少最为明显,减少达60-70%。术后1周脑血流减少最多,8周后手术组和对照组的脑血流量无显著差异,因此2VO模型适合用于慢性脑缺血研究【8】。Ni JW【9】研究发现2VO大鼠海马皮层、CAl区和白质进展性神经元损害和导致认知功能下降。Kazunori Miki【4】研究表明脑组织长期处于低灌注状态,氧化应激损伤大脑白质和灰质,继而发生退行性病变和认知功能障碍。在本研究中,2VO组大鼠皮质和海马CA1区的8-OHdG和4-HNE含量均较假手术组明显增多;2VO组大鼠平均潜伏期时间显著多于假手术组,而目标象限游泳时间显著少于假手术组;这说明慢性脑低灌注过程氧化应激可能引起大鼠DNA、脂质受损和认知功能下降。
4-HNE是脂质过氧化反应最具代表性的醛基产物,能与膜蛋白结合导致膜通透性增加和膜蛋白酶失活,或者损伤细胞膜受体,细胞代谢发生紊乱,从而引发疾病的发生。氧化应激同时引起DNA断裂、碱基修饰受损和破坏DNA修复酶、DAN聚合酶和DNA剪切酶等各种酶类物质,最终导致DNA在合成与分裂过程中发生异常。8-OHdG是DNA氧化应激损伤的主要产物,其含量可反应氧化应激损伤程度。
 
 
 
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