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用兔IgG筛选噬菌体展示免疫球蛋白结合分子组合文库
 

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更新日期:2013-07-26 16:13

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自然界中许多细菌表达多种与宿主免疫球蛋白、血清白蛋白、纤维蛋白原等血清蛋白具有结合活性的蛋白[1],并通过此介导细菌的致病性。其中,Protein A(金黄色葡萄球菌蛋白A, SpA)、protein G(链球菌蛋白G, SpG)、protein L (厌氧菌大消化链球菌属蛋白L, PpL)是三种免疫球蛋白(immunoglobulin, Ig)结合活性的细菌表面蛋白,是细菌重要的致病因子之一[2]。但它们的Ig结合特性各不相同,protein Aprotein G与哺乳动物抗体的Fc区有很高的亲和力,且两者在Fc分子上的结合部位是重叠的,均为IgG的第二个及第三个恒定区(CH2γ,CH3γ)间的分界面[3] ,该特定的区域即是抗体效应子的主要位点。Protein A还可以结合由人VHIII 基因家族编码的Fab片段,因此它除了具有与IgG较强的亲和力外,还能结合其它类型的Ig[4]Protein G可以结合IgGFab段,其识别部位定位于γ链的第一个恒定区(CH1γ),所以它仅结合IgG, 并具有更高的亲和力[5]。而protein L结合免疫球蛋白的部位为其κ轻链可变区。Protein Aprotein GFc分子上的结合部位是重叠的,但不同种属动物IgGFc序列并不一样,那么,这三种IBPs[immunoglobulin (Ig)–binding proteins]对不同种属IgG的结合活性是否相同?

本实验室徐容构建了由protein Aprotein L单结构域构成的噬菌体展示Ig结合分子单结构域组合文库PALn库,并用人免疫球蛋白对该文库进行体外进化亲和筛选,获得了多种非天然形式存在的新的Ig结合分子结构,证明了SPAPpL单结构域随机组合后仍具有Ig结合性,也从新的角度证实了protein Aprotein L 的单个结构域即具有Ig结合功能[6]。本实验室蒋少华利用徐容所筛选出的代表性新Ig分子,即为SPAD domainPpLB3 domain 交替重排所得到的分子,LD3(B3-D-B3)LD5(B3-D-B3-D-B3),进行了一系列的功能实验,证实了,较4L (B3-B3-B3-B3) SpA而言,此两种分子显示出对IgG-F(ab0)2, IgM, and IgA的绝对结合优势,证明了重排后的IBPs具有双结合抗体性质[7]。本实验室杨华以protein Aprotein Gprotein L分子中的代表性Ig结合单结构域作为建库的结构单元,构建了噬菌体展示免疫球蛋白结合分子单结构域随机组合文库PALG库,并应用4种不同的人Ig分子对其进行分子进化选择,其中,人IgG对其分子定向进化获得了PA-A—PG分子结构形式[8~9]那么,如果用其他动物IgG对其进行分子进化,所得到的结构是否会不同?如果相同,可证实他们的效应子具有共同的保守序列,且决定其对Ig的结合活性。如果不同,可说明不同物种效应子对Ig结合效力不同,可由此追踪其具体分子结构。于是,本实验利用兔IgG对同一噬菌体展示Ig结合分子单结构域随机组合文库­­­­PALG库进行高通量体外分子进化筛选,观察所筛选出的优势序列是否存在差异,从而从分子进化的角度阐明不同种属IgG的效应子是否具有相同的Ig结合活性。

研究效应子构象是否改变的关键是如何能敏感地检测出抗体效应子构象的改变。噬菌体展示体外分子进化方法是一种十分高效、敏感、准确且方便易行的方法,本实验室潘卫等长期从事噬菌体展示及相关技术的研究,曾对噬菌体展示载体进行了多次改造,建立了自主的噬菌体展示及筛选的技术平台, 成功地展示了蛋白A、重组人淋巴毒素、干扰素α等生物活性分子以及HCVHGVLT变异体等基因文库[10~13],积累了丰富的研究经验和深厚的工作基础,为本课题的顺利进行创造了良好的条件。

本实验具体操作中我们选用包含了能与抗体效应子特异结合的细菌蛋白Protein A protein LProtein G中具有同源序列代表性的免疫球蛋白结合单结构域,,即Protein AD结构域(PA-D)、A结构域 (PA-A)Protein G B2结构域(PG-B2) protein LB3结构域(PL-B3)为基本单位,并以随机连接肽相连接的具有高度多样性的单结构域随机组合文库[10],将该组合文库展示于噬菌体表面,再应用兔IgG对其进化筛选,分析比较其筛选所得到的优势展示序列是否与人IgG所筛选的优势序列存在差异。由于该随机组合文库包含有上百万种因组合方式不同和连接肽序列不同而使结合特性有所改变的重组分子,因此,当用一种特定构象的抗体效应子对该文库进化筛选时,与这种构象结合最强的组合分子都会被选择出来,也就是说,只要效应子的构象稍有差别,就能从文库中选择出序列不同的组合分子,从而敏感地分析出效应子构象的变化。进一步选取这些不同筛选所获得的代表性单克隆序列,分别检测与兔IgG和人IgG的结合活性,观察不同导向的进化序列与不同状态抗体的结合是否有倾向性的差别,从而论证不同种属的IgG效应子(Fc段)构象是否不同,以及该不同构象是否对其结合特性产生影响。以此探讨不同种属抗体结合Ig的一种新的机制,同时也为分析评价一些应用型抗体如基因工程抗体药物的效应子功能提供一个新的手段。

 
 


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